El código de tres letras gracias a un agente intercalante. Un regalo de magos.

El 30 de diciembre de 1961 Francis Crick, Leslie Barnett, Sidnney Brenner and Watts-Tobin publicaron un artículo que fue un hito de la investigación científica. Es un gran ejemplo del uso del pensamiento, la lógica y la experimentación para la resolución de problemas biológicos y a primera vista solo resolubles por técnicas más directas como la secuenciación. Técnicas que no existían en su día pero que luego corroborarían el resultado.

Los resultados que le sacaron a los bacteriófagos apoyaban la idea de que el código genético va escrito de tres en tres letras, en tripletes, que puede haber varios tripletes que se traduzcan en un mismo aminoácido, o lo que es lo mismo que es degenerado, que dichos tripletes no solapan, no solapante, que no hay comas, y que hay un punto o marca específica de comienzo para cada secuencia codificante de un gen. Pero lo interesante es como dedujeron de los experimentos con fagos mutantes esas conclusiones.

Ya se sabía, por el rompedor experimento de Nirenberg y Mattahei de ese mismo año, 1961, concretamente en mayo, que la secuencia de ARN poliU (UUUUUUUUUU) se traducía, en un sistema libre de células, a un péptido compuesto por muchas fenilalaninas. Y por tanto, que de alguna manera varias ‘ues’ codificaban el aminoácido fenilalanina pero no se conocía la manera concreta en la que esto ocurría. Hubiera sido un buen momento para abandonar y esperar a que el código se mostrara a sí mismo por traducción de otras secuencias conocidas cuando mejoraran la técnicas, pero Crick, Brenner y los demás colaboradores siguieron adelante.

DNA intercalanting agent proflavin acridine mutagen frameshift mutation replication

Proflavina, es una acridina con un nucleo de flavina que puede penetrar en las estructuras dermales y epidermales en las células teñidas in vivo y que se acumula en el nucleo celular. La asociación de la proflavina con el ADN produce un efecto muy específco, la inserción o delección de una base desplazando el marco de lectura y por tanto, posibles cambios severos e importantes sin sentido en la proteína producida.

Para la resolución experimental y lógica del problema eligieron un sistema ideado por Seymour Benzer* a finales de la década de 1950 que utilizaba mutaciones en la región rII del virus bacteriofago T4, un fago que infecta a bacterias. Esta región contiene dos genes adyacentes, A y B, involucrados en la lisis de dos cepas distintas de e. coli, llamadas B y K que pueden infectar. Los fagos mutantes en este gen rII (rII-) presentan un fenotipo distinguible pues lisan las bacterias de la cepa B de manera diferente a la de los silvestres o normales. Además, infectan pero no son capaces de lisar las bacterias de la cepa K y por ello los mutantes son facilmente reconocibles por fenotipo.

El método se basa, pues, en infectar a una cepa bacteriana con dos fagos distintos, con distintas mutaciones, los dos en gran cantidad, hacerlos crecer en placas y contar las manchas de un tipo y de otro, y ver su frecuencia de recombinación. Dos mutaciones recombinaran juntas con frecuencia distinta si están alejadas una de la otra que si están muy cerca. De esta manera se pueden producir muchos mutantes distintos del fago y hacer un mapa muy exacto de la posición de cada mutación calculando las frecuencias de aparición de recombinación. Los mutantes se generaban con proflavina, un agente que se intercala entre las bases del ADN y produce fallos en la copia propiciando inserciones o delecciones de una sola base. Las mutaciones con esta acridina en el gen rII eran sin fugas, esto es, conyevaban la pérdida total de la función del gen.

Eligieron un mutante al principio del gen rII B, que no lisaba cepas k, que llamaron FC0 y al que asignaron como mutante con una inserción de una base. Al recombinarlo con otros mutantes rII obtenían en algunas ocasiones no mutantes, o lo que es lo mismo se revertía el tipo silvestre. Al mapear las mutaciones obtenían que estas estaban muy cercanas a ambos lados del sitio de mutación FC0, más arriba y más abajo. De ello dedujeron que la segunda mutación podría estar regenerando en gran parte el marco de lectura del gen produciendo una proteína muy parecida a la silvestre capaz de lisar las cepas K. 

Luego separaron esta mutación supresora del mutante FC0 por recombinación y vieron que cada cambio regenerador de la función de FC0 cuando se presentaba solo producía un fenotipo mutante rII-, sin fugas. Estos mutantes los asignaron como delección de un par de bases. Lo siguiente fue buscar mutantes revertidores de estas mutaciones que lo serían también por adición de un par de bases. Con este juego de fagos mutantes por delección y por adición podrían hacer otra serie de experimentos combinatorios para determinar la naturaleza del código genético. Podían juntar dos, tres mutantes de delección (-) o adición(+)  y ver lo que ocurría.

Los resultados indicaron que las mutaciones (+) solo podían se revertidas por mutaciones (-) cercanas y viceversa. Además, cuando combinaban tres mutaciones (+) o tres (-) cercanas también se producían fagos con fenotipo funcional, parecido al silvestre. Estos mutantes triples tendrían pocos aminoácidos añadidos o eliminados de la proteína original y esta sería funcional. Esto era consistente con un código genético dispuesto en tripletes.

Además, complemetaron estos exprimentos con mutantes en un gen cercano para ver como se comportaba con estas mismas prueba un mutante de fusión en esa misma región rII de fago t4 denominado 1589. Los resultado fueron similares llegando a la conclusión que eran consistentes con un código en tripletes, con varios tripletes que codifican para un mismo aminoácido, con un punto de inicio un marco de lectura definido y secuencial y una señal de parada o stop. Aunque según los autores no excluia completamente un código de seis en seis, menos probable por el gran número de combinaciones.

El artículo tuvo un gran impacto en su día y sus resultados cambiaron la percepción del código genético y de como podía estar codificada la información para la proteínas en los organismos. El experimento del 61 ilustra como combinar conocimiento y perspicacia pueden proporcionar respuestas a las grandes preguntas científicas. Ahora parece todo muy claro y natural respecto a como se almacena y traduce esta información pero entonces una mezcla de técnica, química, microbiología y pensamiento dieron con la clave.

* Nota: El sistema ideado por Benzer se basa en el ideado y desarrollado por Alfred Hershey y Raquel Rotman a finales de los 1940 en el bacteriofago T2, muy similar.
REFERENCIAS

General Nature of the genetic code for proteins. Francis Crick, Leslie Barnett, Sidnney Brenner and Watts-Tobin.
https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBCBJ.pdf

https://www.nature.com/scitable/topicpage/reading-the-genetic-code-1042/

Establishing the Triplet Nature of the Genetic Code. Charles Yanofsky.Essay| Volume 128, ISSUE 5, P815-818, March 09, 2007.

Proflavine an acridine DNA intercalating agent and strong antimicrobial possessing potential properties of carcinogenMansour K. Gatasheha, S.Kannanb, K.Hemalathac, N.Imranad

The Genetic Code: Francis Crick’s Legacy and Beyond. Koji Tamura

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