GFP Una historia luminosa e improbable

La historia está llena de pasos improbables de individuos o grupos que determinan los logros y actividades posteriores de otros individuos o grupos. Además en la actividad científica rara vez las cosas se encauzan de manera previsible y tampoco suelen salir a la primera. La historia de la proteína verde fluorescente GFP ilumina de forma clara esta perspectiva, es un revolución improbable, muchas cosas que por suerte no se dieron hubieran dado a traste con este descubrimiento, por eso hay que tener cuidado con la fragilidad los casos positivos y sacar conclusiones correctas. Finalizando el año internacional de la luz contamos un descubrimiento con muchas sorpresas que ilumina la química de los sistemas vivos.

Todo comenzó con Osamu Shimomura en los sesenta estudiando la luminiscencia de unas pequeñas medusas. Con ellas descubrió y aisló una proteína fluorescente, la aequorina de la medusa Aquoerea Victoria en el laboratorio Friday Harbor cerca de Vancouver en la costa oeste de Estados Unidos. Durante mucho tiempo intentó hacer funcionar la proteína aislada que causaba la reacción luminiscente, pero se le resistía y así estuvo mucho tiempo probando cosas diferentes. Pero, un día, tras otra tanda de experimentos fallidos, dejó las muestras en la pila para lavar junto con otros restos del mar y cuando se disponía a marchar, apagó la luz y vio como la pila resplandecía con luz azul. Las muestras de proteína aislada se habían juntado con agua de mar y lucían intensamente. La respuesta como vieron poco después estaba en el calcio que contiene el agua de mar. La aequorina necesitaba de iones calcio para emitir luz, de echo, en la actualidad se utiliza como sonda para estudiar la señalización celular dependiente de calcio, se libera calcio y donde este presente luce.

La luz azul estaba bien pero la medusa era verde, así que debía de haber otro intermediario que produjera dicha luz verde. Simomura aisló la proteína que denomino proteína verde fluorescente, GFP, que no necesitaba calcio ni nada, solo estar en presencia de luz azul o ultravioleta. Estudiando esta pequeña proteína de 238 aminoácidos logró dar con la estructura del compuesto que capta la radiación azul la reemite como luz verde. Normalmente este tipo de proteínas acoplan un compuesto fabricado aparte como el hemo de la hemoglobina o el retinal de las proteínas responsables de la visión, pero en la GFP no esa así. El cromóforo, que es como se llama al compuesto responsable del color, se producía con los átomos de la propia secuencia de la proteína y necesitaba de algo de oxígeno. Lo que no se sabía todavía es si la reacción que formaba esta antena-filamento necesitaba de otras proteínas asistentes. Esto era crucial, pues su futuro como sonda voyager celular dependería de su autonomía.

Ahora sabemos que el cromóforo se produce por la reacción autocatalítica de una triada de átomos muy especial de la secuencia Ser65-Tyr66-Gly67. La estructura parece un farol, con laminas beta dispuestas formando un cilindro o camisa protectora y una hélice alfa en el eje donde se forma el cromóforo a modo de antena-filamento muy estable y protegido. Solo necesita de oxígeno para su correcta formación.

El siguiente paso fue dado por Douglas Prasher que tuvo la idea de buscar y aislar el gen para así poder expresar la proteína en otros organismos y utilizarla como baliza. A su vez Martin Chalfie de Columbia oyó hablar de esta proteína en un seminario y según cuenta él se volvió loco de ilusión, como trabajaba con el gusano transparente c. Elegans tuvo la idea de poder estudiar partes de este organismo introduciendo la GFP para poder ver con claridad muchos procesos, si era capaz de clonarla y hacerla lucir. Al día siguiente habló con Prasher y quedaron para colaborar, pero azares de la vida, por un malentendido pensaron el uno del otro que habían abandonado la GFP. Prasher en 1992 logró clonar el gen en la bacteria E. Coli pero no logró que luciera antes de que se le denegasen más fondos ni comunicar con Chalfie, y este a su vez al no tener noticias del otro pensó que no había logrado su objetivo.

 gfp EcoR1 restriction fragment clone sequence-lambda douglas prasher e coli cDNA

Sequencia de la GFP en verde más un añadido rojo resultado del corte con la enzima ecoRi

El giro se produjo en 1993 cuando una estudiante Ghia Eurskirchen experta en florescencia llegó a laboratorio de Chalfie, fue cuando este le encargó mirar la GFP y al buscar la recién instalada búsqueda medline, allí en primera línea aparecía Douglas como poseedor de la secuencia buscada. Le llamaron y en unas semanas tenían el ADN complementario con la secuencia de la proteína. El fragmento de secuencia que Prasher había obtenido contenía el gen y dos secuencias accesorias al principio y al final que flanqueaban el gen (en la figura marcadas en rojo). Normalmente lo que se haría es obtener este fragmento cortándolo con un enzima e insertarlo directamente en el organismo de expresión, por ejemplo la bacteria E. Coli. Pero Martin Chalfie en un golpe de suerte decidió amplificar la secuencia codificante nada más, añadiendo un paso de PCR. El producto obtenido lo introdujo Ghia Euskirchen en E.Coli y voilá en un mes tenían las bacterias iluminado su placa petri.

Primera foto de E. Coli luciendo gracias a la proteína verde fluorescente GFP transplantada de la medusa Aequorea Victoria descubierta por Osamu Shimomura. Son como el Hulk, la masa, que se vuelve verde ante un estímulo, en este caso luz UV.

Primera foto de E. Coli luciendo gracias a la proteína verde fluorescente GFP transplantada de la medusa Aequorea Victoria descubierta por Osamu Shimomura. Son como el Hulk, la masa, que se vuelve verde ante un estímulo, en este caso luz UV.

El siguiente paso llevado a cabo por Yuan Tu fue insertar el gen en el gusano C. Elegans, concretamente en las neuronas mecanosensoras y con suerte también por el promotor escogido lograron que estas células animales lucieran resplandecientes dentro del bichillo, que fue portada de Science no sin algunas pegas debido al color de portada, verde que es difícil de reproducir con fidelidad.

Portada de science la GFP se puso de largo ante la comunidad científica, desde entonces luge en cientos de tejidos y organismos.

Portada de science la GFP se puso de largo ante la comunidad científica, desde entonces luge en cientos de tejidos y organismos.

A partir de este punto el equipo de Roger Tsien mejoró la intensidad de la Luz verde de la GFP y se obtuvieron otros colores cambiando la secuencia que forma el cromóforo o aminoácidos adyacentes. Además se logró expresar la GFP unida a otras proteínas de modo que se pudieran ver en su entorno biológico celular su localización en tiempo y espacio mostrando un motón de procesos de forma muy visual y atrayente. Pero eso es otra quimhistoria.

Puedes ver la versión del Nobel Martin Chalfie de la historia en el video titulado “GFP, Lighting up Life” Dr. Martin Chalfie, Nobel Laureate que es digna de ver para obsevar las carambolas del proceso científico. También habla sobre financiación científica y ciencia básica, una afirmación que me ha llamado la atención es que ‘ellos nunca escribieron o solicitaron una subención para fianciar GFP, solo hicieron los experimentos’, no se pueden adelantar los experimentos ni su importancia.

La ciencia es una actividad humana compleja que navega por aguas desconocidas y como tal está llena de azarosas dichas y desdichas y casi nunca se puede predecir porque faros se pasará y menos el puerto al que se llegará. La GFP ilumina nuestro conocimiento y comprensión de muchos fenómenos biológicos. Además de haber aportado algunas imágenes muy bellas e impactantes a la ciencia, que falta le hace.

El premio Nobel de Química de 2008 fue concedido a: Osamu Shimomura, Marine Biological Laboratory (MBL), Woods Hole, MA, USA and Boston University Medical School, MA, USA, Martin Chalfie, Columbia University, New York, NY, USA y Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA. “por el descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente, GFP”.

Esta entrada participa en la LIII edición del Carnaval de Química, alojada en el blog quimidicesnews de @quimidicesnews”.

REFERENCIAS

Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. “Green fluorescent protein as a marker for gene expression.” Science Volume 263, pages 802-805 (1994).

The green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea victoria forms an intrinsic chromophore through cyclization and oxidation of an internal tripeptide motif [Prasher, D. C., et al. (1992) Gene 111, 229−233; Cody, C. E., et al. (1993) Biochemistry 32, 1212−1218].

Chromophore Formation in Green Fluorescent Protein. Brian G. Reid and Gregory C. Flynn. Institute of Molecular Biology and Department of Chemistry, University of Oregon, Eugene, Oregon 97403Biochemistry, 1997, 36 (22), pp 6786–6791 DOI: 10.1021/bi970281w

Chromophore Formation in Green Fluorescent Protein. Brian G. Reid and Gregory C. Flynn. Biochemistry, 1997, 36 (22), pp 6786–6791 DOI: 10.1021/bi970281w

Anuncios

Un comentario en “GFP Una historia luminosa e improbable

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s