Los tiempos en los que las enzimas no eran puras.

Hubo un tiempo no muy lejano en los que las enzimas no eran puras ni tenian porque ser proteínas.

En la actualidad aislar y purificar un enzima es algo común y hay muchas técnicas disponibles, pero no siempre fue así. Hubo un tiempo en el que no se sabía la naturaleza de los catalizadores que posibilitaban las reacciones de los procesos vivos. Ni se sabía que eran, ni si se podían separar unas de otras, ni se creía que fuera posible. James Batcheller Sumner el químico y posterior premio Nobel pionero en esta causa culpaba en cierta manera al pensamiento firmemente establecido. Comprobó que la inercia de las ideas de escuelas de pensamiento establecidas es grande, y que no es tan fácil colocar un nuevo descubrimiento.

En concreto la escuela de Willstäter, Premio Nobel de química de 1915 por sus estudios sobre pigmentos de plantas y padre de la cromatografía en papel, sostenían en los años 20 que las enzimas que estudiaban no eran ni lípidos, ni carbohidratos, ni proteínas y que se encontraban en pequeñísimas cantidades imperceptibles. Su influencia como es normal era muy grande y difícil de vencer.

El químico James Sumner se planteó dedicar su tiempo a investigar el problema de los enzimas, comenzó en el otoño de 1917, a partir de la semilla de un tipo de judía gigante que se sabía contenía actividad capaz de degradar urea. La semilla de soja también poseía esta actividad pero en menor ‘cantidad’ Quería ser el primero en intentar purificar totalmente un enzima y ver que eran. El trabajo tozudo con muchísimos intentos fallidos, abandonos y reintentos pero con la suerte de haber elegido el sistema adecuado le llevaron a una forma de aislar y obtener unos cristales con una potente actividad ureasa. Una especie de kriptonita para la urea. No convencido de su pureza total cambio el método de aislamiento fraccionado y el disolvente de extracción. A la mañana siguiente obtuvo un líquido sin precipitado y tras observar las gotas de la solución por el microscopio vio que contenían unos pequeñísimos cristales. Además la actividad ureasa de estos cristalillos era muy, muy alta, incluso mayor que la inicial. Este y otros indicios le llevaron a pensar y a comunicarle a su mujer por teléfono a su mujer “He cristalizado la primera enzima pura”. Era el año 1926 pero los cristales no valían para un anillo, valían mucho más.

Cristales de Ureasa podían ser disueltos y recristalizados sin perdida de la actividad enzimática.

Cristales de Ureasa podían ser disueltos y recristalizados sin perdida de la actividad enzimática.

James Batchelier Sumner

James Batchelier Sumner

Las enzimas son moléculas muy grandes que difunden y cristalizan relativamente mal o lentamente. Según Sumner sin las ultracentrífugas de Svedberg o el aparato de electroforesis de Tiselius, las evidencias que ofreció para probar sus afirmaciones fueron más acumulativas. No obstante la idea de la posibilidad de cristalización de las enzimas y su origen proteico no fue algo aceptado de inmediato, no hasta que se cristalizaron más y más proteínas. Fue en 1930 cuando Northrop obtuvo la pepsina en forma cristalina, más tarde Northrop-Kunitz la trypsina y la quimiotrpsina también cristalizaron y ya fue un no parar. En 1946 se habían cristalizado unas 30 enzimas. Aislar y cristalizar cada enzima requería su método concreto, fuente, y era un arte.

Luego vendrían muchas pruebas para caracterizarla:s cinéticas enzimáticas, digestiones con enzimas proteolíticas o inmunización de animales para obtener los anticuerpos anti ureasa.

La ureasa de Sumner seguía guardando muchos secretos. La enzima cataliza la conversión de la urea (2HN-CO-NH2) en amoniaco y urea. Es fundamental para obtener nitrógeno de los almacenes en plantas, hongos y bacterias cuando se necesita en cantidades extraordinarias. El mecanismo de acción era desconocido así como los componentes cómplices de la desaparición de la urea.

La enzima ureasa contiene cuatro dominio estructurales. Uno de ellos contiene un centro bi-niquel. Los dos atomos de níquel estan separados por 3.5A. Una lisina modificada (carbamilada) que proporciona un ligango con oxígeno a cada níquel, que explica porque el dióxido de carbono es imprescindible para la activación de la apoenzima. Uno de los mecanismos propuestos dice que la urea se liga con el primer níquel completa su coordinación tetraedrica y un ligando hidróxido del segundo níquel ataca el carbono carbonílico. La sorprendentemente alta similaridad estructural  entre el dominio catalítico de la ureasa y de la adenosina desaminasa revela a ejemplo sorprendente de divergencia de un sitio activo.

La enzima Ureasa contiene cuatro dominio estructurales. Uno de ellos contiene un centro bi-niquel. Los dos atomos de níquel estan separados por 3.5A. Una lisina modificada (carbamilada) que proporciona un ligango con oxígeno a cada níquel, que explica porque el dióxido de carbono es imprescindible para la activación de la apoenzima. Uno de los mecanismos propuestos dice que la urea se liga con el primer níquel completa su coordinación tetraedrica y un ligando hidróxido del segundo níquel ataca el carbono carbonílico. La sorprendentemente alta similaridad estructural entre el dominio catalítico de la ureasa y de la adenosina desaminasa revela a ejemplo sorprendente de divergencia de un sitio activo.

No fue hasta 1975 cuando se descubrió que el corazón de este enzima necesitaba níquel y que el proceso de ensamblaje de este metal en la enzima requería otras enzimas y energía. Además no sólo necesitaba un átomo de níquel por molécula sino dos. Era un helado con dos bolas de níquel. Esto por supuesto disparó la imaginación para comprender como era el proceso por el cual la enzima degradaba la urea. Y lo hace muy bien, la vida media de la urea en el ambiente es de varios años unos tres y la enzima es capaz de acelerar esta descomposición en 10^14 veces.

Ya en 1995 el flamante premio Nobel de 2013 Karplus y colaboradores resolvieron la estructura tridimensional de la enzima procedente de Klebsiella aerogenes, que es una bacteria que infecta en ocasiones el tracto urinario rico en urea. Es culpable de muchos casos de piedras por precipitación al subir el pH de la orina haciendo más insolubles muchas sales. En la estructura se apreciaban la posición que ocupan los dos átomos de níquel en el cetro de reacción separados 3.5A y propusieron un mecanismo de reacción que sigue en cuestión.

En la actualidad se ha resuelto la estructura de otras muchas ureasas provenientes de otros organismos en concreto de la semilla de la judía de Sumner y son muy similares entre ellas. El Haba de Sumner resultó un haba mágica que nos hizo subir muy alto en la comprensión de los componentes de los cristales de la vida.

Nota: Este post participa en el XXVIII Carnaval de Química, que se aloja en este blog Flagellum @3Dciencia.

REFERENCIAS:

James B. Sumner. THE ISOLATION AND CRYSTALLIZATION OF THE ENZYME UREASE: PRELIMINARY PAPER J. Biol. Chem. 1926 69: 435-441.

Jack bean urease (EC 3.5.1.5). A metalloenzyme. A simple biological role for nickel? J Am Chem Soc. Dixon NE, Gazzola TC, blakeley RL, Zermer B. 1975 Jul 9;97(14):4131-3.

The crystal structure of urease from Klebsiella aerogenes. Jabri E, Carr MB, Hausinger RP, Karplus PA. Science. 1995 May 19;268(5213):998-1004.

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